มูลนิธิคณะพยาบาลศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดลฯ จัดตั้งขึ้นตามวัตถุประสงค์ของคณะกรรมการจัดงานฉลอง 84 ปี คณะพยาบาลศาสตร์ (โรงเรียนพยาบาลผดุงครรภ์และอนามัย คณะแพทยศาสตร์ศิริราชพยาบาล) โดยมีคุณหญิงดวงใจ สิงหเสนี คณบดีคณะพยาบาลศาสตร์ในสมัยนั้น เป็นประธานงานฉลองครบรอบ 84 ปี ซึ่งจัดขึ้นเมื่อวันที่ 5 – 7 สิงหาคม พ.ศ. 2525 โดยการนำเงินส่วนหนึ่งที่ได้จากการจัดงาน ตั้งเป็นกองทุนเริ่มต้นของมูลนิธิคณะพยาบาลศาสตร์ เป็นจำนวนเงินทั้งสิ้น 1,986,736.71 บาท (หนึ่งล้านเก้าแสนแปดหมื่นหกพันเจ็ดร้อยสามสิบหกบาทเจ็ดสิบเอ็ดสตางค์)

             มูลนิธิคณะพยาบาลศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดลฯ ได้รับอนุญาตจากสำนักงานคณะกรรมการวัฒนธรรมแห่งชาติ ให้ดำเนินการจัดตั้งเป็นมูลนิธิขึ้นเมื่อวันที่ 28 มีนาคม พ.ศ. 2527 ตามเลขอนุญาตที่ ต. 157/2527 และกระทรวงมหาดไทยอนุญาตให้จดทะเบียนจัดตั้ง เพื่อให้มีฐานะเป็นนิติบุคคล ตามนัยหนังสือที่ มท. 0402/18962 ลงวันที่ 20 พฤศจิกายน พ.ศ. 2527 และกรุงเทพมหานครได้ให้อำนาจจัดตั้งมูลนิธิฯ ขึ้น เมื่อวันที่ 24 ธันวาคม พ.ศ. 2527 เลขทะเบียนลำดับที่ 2681 โดย คุณหญิงดวงใจ สิงหเสนี เป็นผู้ยื่นเรื่องราวขออนุญาตจัดตั้งมูลนิธิฯ ด้วยเงินทุนจดทะเบียนเริ่มต้นจำนวน 2,000,000.00 บาท (สองล้านบาทถ้วน) จากเงินที่ได้จากการจัดงานฉลองครบรอบ 84 ปีส่วนหนึ่ง และสมทบด้วยเงินรายได้ของคณะพยาบาลศาสตร์

             คุณหญิงดวงใจ สิงหเสนี ได้ดำเนินการขอพระราชทานกราบทูลอัญเชิญ สมเด็จพระเทพรัตนราชสุดาฯ สยามบรมราชกุมารี ทรงเป็นองค์อุปถัมภ์มูลนิธิคณะพยาบาลศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดลฯ ตามหนังสือคณะพยาบาลศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล ที่ ทม 0813/175 ลงวันที่ 9 กุมภาพันธ์ 2526 และหนังสือมูลนิธิคณะพยาบาลศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดลฯ ที่ 3/2527 ลงวันที่ 26 ตุลาคม 2527

             สมเด็จพระเทพรัตนราชสุดาฯ สยามบรมราชกุมารี ทรงรับมูลนิธิคณะพยาบาลศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดลฯ ไว้ในพระราชูปถัมภ์ ตั้งแต่วันที่ 28 กุมภาพันธ์ 2528 เป็นต้นไป ตามหนังสือสำนักราชเลขาธิการ สวนจิตรลดา ที่ รล 0006/1642 ลงวันที่ 27 กุมภาพันธ์ 2528 และหนังสือสำนักเลขาธิการคณะรัฐมนตรี ทำเนียบรัฐบาล ที่ นร 0201/2978 ลงวันที่ 28 กุมภาพันธ์ 2528